HRM(High Resolution Melting，高分辨率溶解曲線)，作為上成熟的點(diǎn)突變掃描與檢測技術(shù)，在人類疾病相關(guān)基因鑒定、植物誘變育種基因突變檢測及基因分型等多個(gè)領(lǐng)域都得到了廣泛的應(yīng)用。現(xiàn)在我們就重點(diǎn)關(guān)注一下HRM技術(shù)在植物育種中的具體應(yīng)用。

    現(xiàn)代農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域中，分子遺傳育種在植物育種中發(fā)揮著越來越大的作用。HRM之所以作為分子育種中常用的突變檢測、基因分型技術(shù)，是由于HRM不受突變堿基位點(diǎn)和種類的局限，無需使用序列特異性探針，具有高靈敏度、操作簡單、高通量、成本低等優(yōu)點(diǎn)。

HRM在植物誘變?nèi)后w中的突變掃描

    為了獲得種質(zhì)資源，常采用物理誘變、化學(xué)誘變等技術(shù)處理植物樣本，而這些誘變技術(shù)通常會(huì)導(dǎo)致點(diǎn)突變、小片段插入缺失突變等。在獲得誘變?nèi)后w后，針對特定基因設(shè)計(jì)特異性引物，采用HRM技術(shù)高通量篩選誘變?nèi)后w，獲得突變個(gè)體。由于HRM技術(shù)速度快、成本低、通量高，所以非常適合植物誘變?nèi)后w的點(diǎn)突變掃描。

    在異源六倍體小麥中，Dong等*次應(yīng)用HRM分析EMS(Ethylmethane Sulfonate，甲基磺酸乙酯)誘發(fā)的點(diǎn)突變?nèi)后w，實(shí)現(xiàn)同時(shí)掃描小麥SSII-A、SSII-B和SSII-D。他們在SSII-A、SSII-B和SSII-D的C末端保守區(qū)域上相似性很高的一段序列(532bp含17個(gè)SNPs)設(shè)計(jì)引物，分幾個(gè)片段(長度約100～250bp)可同時(shí)擴(kuò)增三個(gè)基因，然后對小麥農(nóng)家種Ventura的EMS誘變?nèi)后w進(jìn)行HRM分析。對140個(gè)樣品的未知突變進(jìn)行掃描，片段ABD6-1由于其G+C含量高(63.72%)、固有的SNP較多(5 SNIPs)及二級(jí)結(jié)構(gòu)造成的影響，有15個(gè)樣品出現(xiàn)差異的熔解峰，結(jié)合其他手段進(jìn)一步證實(shí)該群體擴(kuò)增出的ABD6-1片段有8個(gè)突變體，而HRM分析掃描出其中的7個(gè)；片段ABD2-9中有6個(gè)突變體而HRM掃描出其中的5個(gè)；片段ABD12-22包含的6個(gè)突變體均被HRM掃描出。可見，HRM掃描未知突變的靈敏度較高(83.3%～100%)，且常受到G+C含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、DNA樣品純度等因素的影響。

HRM在基因分型中的應(yīng)用

    目前主流高通量SNP基因分型方法包括SNP芯片分型技術(shù)、KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）競爭性等位基因特異性PCR技術(shù)等，特別適合于需要篩選多個(gè)SNP位點(diǎn)且群體量大的樣本群體。除此之外，HRM分析應(yīng)該是僅次于以上兩種高通量篩選技術(shù)的*選擇。HRM分析應(yīng)用于植物基因分型，不需要特異性序列探針，在PCR反應(yīng)后直接對DNA雙鏈逐漸升溫變性熔解，然后通過光學(xué)檢測系統(tǒng)采集熒光信號(hào)變化并繪制溶解曲線，軟件會(huì)根據(jù)曲線準(zhǔn)確將野生型、雜合型、純合型樣本區(qū)分開來。（如圖）

      HRM實(shí)驗(yàn)的成功，除了周密的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)外，一款合適的儀器也是獲得準(zhǔn)確實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)*的保證。根據(jù)HRM實(shí)驗(yàn)原理，對于儀器來講，的溫度均一性和高數(shù)據(jù)采集密度是保障實(shí)驗(yàn)成功的核心所在。由于點(diǎn)突變引起的解鏈溫度差異很小，一般要求儀器的溫度均一性小于0.2度才能檢測出突變引起的溫度差異，所以儀器的溫度均一性越好，儀器的檢測靈敏度就會(huì)越高。此外，儀器需要具備高的數(shù)據(jù)采集密度，才能實(shí)時(shí)地記錄整個(gè)過程的溫度變化。

    瑞士Roche LightCycler 480Ⅱ推出的實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)，以其的性能深受廣大科研工作者的青睞。對于HRM實(shí)驗(yàn)，LightCycler 480Ⅱ熒光定量PCR系統(tǒng)除了具備以上兩點(diǎn)要求外，zui大的優(yōu)點(diǎn)在于速度非常快且操作簡便，專業(yè)的軟件分析功能更有助于突變個(gè)體的鑒別，支持一鍵數(shù)據(jù)導(dǎo)出，方便實(shí)用，是實(shí)驗(yàn)室HRM實(shí)驗(yàn)的*選擇！